Inscription / Connexion Nouveau Sujet
Calcule de l'activité enzymatique de la phosphatase alcaline
Bonjour,
Je suis en train de faire un compte rendu sur un tp ou le but est de mesurer l'activité enzymatique et spécifique de la phosphatase alcaline.
Il met demander de calculer la vitesse à partir des courbes puis de calculer pour chaque conditions l'activité enzymatique AE (en katal) et l'activité spécifique AS(en katal/mg).
Nous avons pris les mesures des réactions selon 3 conditions:
- Condition optimale de l'enzyme (0,5mL d'enzymes dans la solution à 37°C)
- A température ambiante (0,5mL d'enzyme à 20°C)
- Avec moins d'enzyme (0,25mL d'enzyme à 37°C)
Je pensais avoir réussi les calculs mais ils ne sont malheureusement pas cohérents. En effet, je trouve que l'AE et l'AS sont supérieur avec des conditions non optimales pour l'enzyme (température à 20°C ou moins d'enzyme) que les conditions optimales (à 37°C). Ce n'est pas logique et je ne trouve pas où j'ai pu faire une erreur... Merci de m'éclairer.
Cinétique 1 : Standard
Détermine Vi : On trace la tangente des premiers points de la droite de f(temps)=pNP et vi est égale à la pente de cette tangente :
Vi = (yb-ya)/(xb-xa) = (10-2)/(10-2)= 1µg de pNP par minute.
Ce qui nous fait par seconde : 1/60 = 0,017µg.
La vitesse initiale à température ambiante est de 0,017µg/s.
Détermine AE :
On met la quantité d'enzyme en mole : On sait que M(pNP)=139,11g/mol.
Pour 0,017µg =0,017.10-6g on a : 0,017.10-6/139,11 = 1,22.10-10 mol.
Nous savons que la phosphatase alcaline à 0,2 Unité Enzymatique pour 1mL (énoncé). Or durant ce tp nous avons utilisé 1mL d'enzyme soir une unité enzymatique de 0,1.
On sait que 1 UE=1katal= 1 mole de substrat/seconde = 1mole de produit/seconde. En effet, dans cette réaction, 1 mole de pNPP (substrat) forme 1 mole de pNP (produit).
Soit pour 0,1 UE nous avons 1,22x10-10 mol/seconde.
Donc pour 1mol/seconde = 0,1/1,22.10-10= 8,2.108 katal.
L'activité enzymatique de la phosphatase alcaline dans les conditions standard est de 8,2.108 katal.
Détermine l'AS : L'activité spécifique de l'enzyme en µkatal par mg. On sait que la masse de protéine est de 10,53µg. Et que 1 katal = 10-6 µkatal
8,2.108x10-6/10,53.10-3 = 7,79.104 µkatal/mg.
L'activité spécifique de la phosphatase alcaline dans les conditions standard est de 7,79.104 µkatal/mg.
Cinétique 2 : A température ambiante
Détermine Vi : On trace la tangente des premiers points de la droite de f(temps)=pNP et vi est égale à la pente de cette tangente :
Vi = (yb-ya)/(xb-xa) = (1-0,2)/(8-1)= 0,114µg de pNP par minute.
Ce qui nous fait par seconde : 0,114/60 = 1,9.10-3µg.
La vitesse initiale à température ambiante est de 1,9.10-3µg/s.
Détermine AE :
On met la quantité d'enzyme en mole : On sait que M(pNP)=139,11g/mol.
Pour 1,9.10-3µg =1,9.10-9g on a : 1,9.10-9/139,11 = 1,37.10-11mol.
Soit pour 0,1 UE nous avons 1,37.10-11mol /seconde.
Donc pour 1mol/seconde = 0,1/1,37.10-11mol = 7,30.109katal.
L'activité enzymatique de la phosphatase alcaline à température ambiante est de 7,30.109katal.
Détermine l'AS :
7,3.109x10-6/10,53.10-3 = 6,93.105 µkatal/mg.
L'activité spécifique de la phosphatase alcaline à température ambiante est de 6,93.105 µkatal/mg.
Je ne vous mets pas la dernière condition, mes calculs restent les mêmes et surement avec la même faute...
Merci d'avance pour vos réponses,
Elsa
Bonjour,
Des calculs numériques sont nettement plus difficiles à suivre que des calculs littéraux, en particulier leur cohérence (type homogénéité) est difficile à vérifier.
Il manque la quantité de substrat, et tel que vous faites le calcul, on a l'impression que vous êtes à saturation (pour confondre vi et vmax), c'est le cas ?
Pour ce qui est des unités : il me semblait (mais je ne suis pas spécialiste) qu'une UI était 1
mol/minute et que d'autre part le katal est une "grosse" unité et donc que trouver 109 katal parait douteux.
"Soit pour 0,1 UE nous avons 1,22x10-10 mol/seconde " me parait auto contradictoire : les deux grandeurs sont les mêmes donc devraient être égales ?
"1mol/seconde = 0,1/1,22.10-10= 8,2.108 katal" là aussi cela me parait auto contradictoire puisque 1 katal=1 mol/seconde. Votre 0,1 est en mol/s et votre 1,22.10-10 est aussi en mol/s, donc le rapport est sans dimension.
Cela ne répond pas vraiment à votre question, mais vous donne quelques pistes de réflexion.
Merci pour votre réponse, cela s'éclaire un peu, mes calculs n'étaient pas du tout cohérents.
Je pense avoir trouvé une autre méthode pour calculer mais la notion d'unité internationale et unité enzymatique est très floue pour moi.
Voici le nouveau calcul pour les conditions optimales:
Vi= 1µg/min (calculer en prenant la pente à l'origine de la courbe de la quantité de pNP en fonction du temps)
On sait que la masse molaire de pNP = 139,11 g/mol.
Soit pour 1.10-6g, on a 7,19.10-9 mole de pNP.
Pour le mettre en unité international (qui est bien en µmol/seconde, vous avez raison) cela nous donne:
7,19.10-3 U.I
On sait que 1katal=6.107.
Soit l'activité enzymatique de la phosphatase alcaline est de 1,20.10-10 katal.
Je pense que l'ordre de grandeur est plus raisonnable seulement je n'ai pas utilisé la donnée de l'énoncé où on nous informe que l'unité enzymatique est de 0,2UE/ml. (Et pour le tp on met seulement 0,5mL).
Je ne vois pas comment l'intégrer dans le calcul qui pour moi est fini et n'a pas de lien avec l'unité enzymatique...
Bonjour,
Vous n'avez pas répondu à ma première question : vous êtes bien à saturation ?
"la notion d'unité internationale et unité enzymatique est très floue pour moi."
C'est simplement la quantité d'enzyme pour avoir une vitesse maximale de 1mol/minute.
Votre calcul de vitesse initiale (maximale) est par seconde donc pas en UI qui est par minute.
Le passage au katal est simplement le passage masse vers (quantité de matière) , donc votre 1,22.10-10 mol/s=1,22.10-10 katal=0,0073 UI assez loin des 0,1 attendus. Donc à éclaircir. Si on avait le texte, cela aiderait.
"En effet, je trouve que l'AE et l'AS sont supérieur avec des conditions non optimales pour l'enzyme".
Non vous trouvez bien en conditions optimales une vitesse de 1µg de pNP par minute et à 20°C, 0,114µg de pNP par minute, donc bien plus petit.
Annuler
connectez vous