Bonjour, nouveau sur le site je viens vers vous car j'ai besoin d'aide. Voici l'énoncé de l'exercice que je n'arrive pas à résoudre :

Le malondialdéhyde (MDA, pKa énolate = 4,5) est un marqueur de l'oxydation des lipides. L'analyse du MDA plasmatique est réalisée après dérivatisation avec la DNPH conduisant à un dérivé hydrazone MDA-DNPH stable. (voir image attachée)

Le protocole de traitement d'échantillon est le suivant : dans un tube à centrifuger, 100 uL de plasma sont ajoutés à 400 uL d'eau, 100 uL d'étalon interne (EI) et 1,5 ML d'une solution aqueuse d'acide trichloroacétique (TCA) à 20% en volume pour précipiter les protéines. Les échantillons sont ensuite agités, mis aux ultrasons pendant 30 secondes puis centrifugés pendant 5 min à 25 000 g. A 1,9 mL de surnageant sont ajoutés 190 uL de l'agent de dérivatisation DNPH (5 mM dans TCA 20% en volume dans l'eau) puis le mélange est incubé 10 minutes à température ambiante. La réaction est stoppée par ajout de 220 uL de NaOH (10M). Le produit MDA-DNPH est extrait deux fois par un mélange cyclohexane : toluène (1:1 ; v/v). Les phases organiques (2 fois 2,4 mL) sont combinées et évaporées pendant 60 min. Le résidu est reconstitué dans 1 mL d'un mélange méthanol : H2O (1:1 ; v/v) avant d'être analysé en chromatographie liquide en phase inverse couplée à un détecteur UV.

Question 1 : quel est l'intérêt de la dérivatisation dans cette étude ?
En vous aidant du nom du MDA, dessiner l'autre forme tautomère du MDA.
Expliquer la valeur du pKa du MDA (pKa écolage = 4,5). Justifier votre réponse en dessinant les deux formes en équilibre.

Question 2 : quel est l'intérêt de l'extraction liquide - liquide dans ce protocole ? justifier votre réponse.

Question 3 : Sachant que les concentrations étalons en sel de MDA sont respectivement de 0,128 ; 0,321 ; 0,803 ; 1,606 uM lors de l'injection, décrire sous forme de tableau la préparation des solutions de la gamme d'étalonnage à partir d'une solution mère du sel de MDA à 20,15 mg.L-1.

Concernant la question 1, je pense avoir réussi : j'ai parlé de l'obtention d'un composé + stable grâce à la dérivatisation et j'ai dessiné la molécule grâce à son nom. Ensuite j'ai fait un diagramme de prédominance : en dessous de pKa la forme est neutre et au dessus la forme est chargé (CO-).

Concernant la question 2, je ne suis pas sur mais je pense que l'extraction LL permet d'obtenir un produit très pur, d'enlever les impuretés.

Mon gros problème est la question 3, je ne sais pas du tout comment l'aborder avec tout ces volumes et ces étapes j une vois pas où en venir.

Merci de l'aide que vous pourrez m'apporter.