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Spectophotométrie
Bonjour à tous,
J'ai récemment effectuer un TP sur la spectrophotométrie et à come à chaque fois que j'en fais un je bloque sur un détail qui fausse toujours mon résultat, c'est pourquoi je demande votre aide.
Donc ce TP consiste à effectuer une gamme étalon de sérum albumine à 25
g/mL et de déterminer une concentration inconnu d'une solution de SAB donné en utilisant les absorbances.
Voici le tableau du protocole :
| N° des tubes | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| SAB 25g/mL (en mL) | 0 | 0.2 | 0.5 | 1 | 1.5 | 2 | |||
| H20 (mL) | 2 | 1.8 | 1.5 | 1 | 0.5 | 0 | 1.6 | 1 | 0 |
| Solution à doser (mL) | 0.4 | 1 | 2 | ||||||
| Bleu de Coomassie (mL) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
J'ai donc calculé mes absorbances :
| Tube n° | D.0 1 à 595 nm | D.0 2 à 595 nm |
| 1 | 0 | 0 |
| 2 | 0.035 | 0.060 |
| 3 | 0.090 | 0.165 |
| 4 | 0.260 | 0.290 |
| 5 | 0.320 | 0.392 |
| 6 | 0.462 | 0.544 |
| 7 | 0.094 | 0.132 |
| 8 | 0.218 | 0.284 |
| 9 | 0.270 | 0.300 |
Je dois donc maintenant tracer la courbe de l'absorbance en fonction de l quantité en SAB/tube
Sachant que dans le tube 1 il y a 0
g/tube
Dans le 2 : (25*0.2=5
g/tube)
Dans le 3 : (25*0.5=12.5
g/tube)
Dans le 4 : 25
Dans le 5 : 37,5
Dans le 6 : 50
g/tube
Voilà mon problème : je dois maintenant à l'aide de l'absorbance trouvé pour ma solution inconnu déterminer leur concentration en
g/tube puis je trouver combien cela fait en g/mL.
C'est cette dernière partie qui coince.
Merci d'avance pour votre aide !
Bonjour,
Pour les six mesures concernant la solution étalon, tu traces la courbe A = f(cm) avec cm : concentration massique en SAB.
Tu vas très probablement obtenir un ensemble de points sensiblement alignés. Soit par une méthode graphique, soit en utilisant un tableur, tu détermines l'équation de la droite moyenne sous la forme : A = k.cm
Connaissant ainsi la valeur de k, la mesure de l'absorbance d'une solution à doser permet de déterminer la concentration massique en SAB de cette solution.
Remarque : la seconde série de mesures (colonne de droite) conduit à des points assez correctement alignés (coefficient de corrélation très proche de 1 ; la première série de mesures est de moins bonne qualité.
Oui j'ai bien compris cette partie mais ce qui me dérange c'est de déterminer cette concentration massique par tube.
Par exemple pour le tube 2, Cm=m/V ; donc je prends m=5g, mais je prends quoi pour V ? 2mL (SAB+H20) ou 0.5mL (SAB) ou 2.5mL (SAB+H20+Bleu de Coomassie) ?
Pour la solution étalon n° 2 : cm=2,0µg/mL ;
Es-tu d'accord avec cela ?
Je développe au cas où ...
Masse utilisée : 25*0,2µg
cette masse est contenue dans 2,5mL ; concentration massique :
cm=(25*0,2)/2,5=2,0µg/mL
oui je suis d'accord. Mon soucis venait du fait que je ne savais pas s'il fallait compter ou non le volume de bleu de Coomassie ajouter dans la détermination de la concentration massique.
Maintenant avec mes absorbances calculées pour ma solution de concentration inconnue je déduis la quantité en microgrammes/tube (puisque j'ai fait un graphique Absorbance en fonction d ela quantité en mcrogramme/tube). cette valeur trouvée je la divise par le volume (2,5mL du coup) et je multiplie par le facteur de dilution,c'est bien cela?
Un peu compliqué... Ce n'est sûrement pas un hasard si la solution mère contient 25µg/mL de SAB alors que le volume des solutions filles est toujours de 2,5mL(25/2,5 = 10 !). La concentration massique en solution fille est, exprimée en µg/mL, égale à 10 fois le volume de solution mère utilisée. Comme je l'ai montré sur l'exemple de la ligne 2 :
à 0,2mL de solution mère utilisée correspond cm=2µg/mL
à 0,5mL de solution mère utilisée correspond cm=5µg/mL
etc...
Tu peux donc directement tracer la courbe A = f(cm)
Personnellement j'obtiens :
pour la première série de mesures : A = 0,0228.cm avec R2=0,993
pour la seconde série de mesures : A = 0,0273.cm avec R2=0,997
La seconde série de mesure est donc a priori plus précise.
Pour les solutions de concentrations massiques inconnues, la mesure de A donne directement cm...
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